Factores a Considerar Al Seleccionar Un Microscopio De Investigación
Este artículo le brinda una breve descripción general de las principales características que debe tener en cuenta al elegir un microscopio óptico de investigación.
Microscopio Leica DMi8 Aspelab
Un microscopio óptico es a menudo uno de los dispositivos centrales en un laboratorio de investigación de ciencias biológicas. Se puede utilizar para diversas aplicaciones que arrojan luz sobre muchas cuestiones científicas. Por lo tanto, la configuración y las características del microscopio son cruciales para la cobertura de su aplicación, que van desde el campo claro a través de la microscopía de fluorescencia hasta la obtención de imágenes de células vivas.
Este artículo proporciona una breve descripción general de las características relevantes del microscopio y resume las preguntas clave que se deben considerar al seleccionar un microscopio de investigación.
¿Qué tipo de muestra usa?
Una de las primeras cosas a considerar al seleccionar un microscopio de investigación es el tipo de muestra que desea explorar. Para muestras fijas montadas en un portaobjetos de vidrio delgado, puede usar un microscopio vertical. Las células vivas exigen características especiales del microscopio porque se mantienen en recipientes de cultivo celular relativamente grandes llenos de medio de cultivo celular.
Figura 1: Izquierda: Portaobjetos de vidrio para montar muestras fijas, p. Ej. cortes histológicos. Derecha: placa de Petri para cultivo celular.
Solo una configuración invertida, con el objetivo debajo y el condensador encima de la muestra, facilita el espacio libre esencial y la proximidad requerida del objetivo a la muestra. Al mismo tiempo, un microscopio invertido mantiene una buena accesibilidad a las células, p. Ej. para añadir micromanipuladores.
Además, las células vivas requieren un entorno adecuado para sobrevivir. La temperatura y la concentración de CO2 deben mantenerse en ciertos niveles. Una cámara climática con los controladores correspondientes es necesaria para cumplir con esta tarea.
Figura 2: Izquierda: un microscopio vertical presenta el objetivo arriba y el condensador debajo de la muestra. Derecha: En un microscopio invertido, esta configuración se da la vuelta para dar a los usuarios más espacio además de la proximidad requerida del objetivo a la muestra.
¿Qué dimensiones necesita?
Muestra microscópica distribuida en tres dimensiones: largo, ancho y alto. Mientras que algunas muestras, como las secciones histológicas, solo se obtienen en la dirección xy, existen otras aplicaciones que exigen la adquisición también en la dimensión z. Para obtener imágenes de volúmenes 3D, p. Ej. de células vivas, se recomienda un revólver objetivo motorizado que pueda guiar su muestra paso a paso a través del enfoque. El software de imágenes debería poder reconstruir las imágenes individuales para visualización en 3D.
Para las células vivas, debe agregar el tiempo de dimensión. En este caso, por ejemplo, la estabilidad del sistema es otra característica crítica. Debido al hecho de que los cambios de temperatura influyen en el sistema de obtención de imágenes durante la adquisición, son esenciales contramedidas eficaces. Un ajuste de enfoque automático como el Adaptive Focus Control (AFC) contrarresta estas influencias térmicas y siempre encuentra el enfoque predefinido.
Figura 3: El Control de enfoque adaptativo (AFC) estabiliza automáticamente el enfoque del microscopio también durante la adquisición de lapso de tiempo a largo plazo. Un sensor detecta los movimientos de un haz de luz LED (850 nm) que se producen si el cubreobjetos que lleva la muestra cambia de posición, p. Ej. debido a la actividad térmica.
¿Qué método de contraste se adapta mejor a su muestra?
La mayoría de las células, especialmente las células animales, investigadas con un microscopio no tienen suficiente contraste intrínseco para ver los detalles finos. Los investigadores utilizan métodos de contraste para solucionar este problema. Mientras que el contraste de fase (PH) y el contraste de interferencia diferencial (DIC) manipulan la luz que pasa a través de la muestra para agregar contraste, también puede teñirla con tintes fluorescentes (inmunofluorescencia) y utilizar respectivamente proteínas fluorescentes.
Según el método de contraste, el microscopio necesita un equipo específico; p.ej. El contraste de fase necesita objetivos especiales, mientras que DIC utiliza ciertos prismas que deben cambiarse a la trayectoria de la luz. Para la microscopía de fluorescencia, necesita cubos de filtro especiales que permitan que las longitudes de onda de luz correctas accedan y salgan de la muestra.
Figura 4: Serie de células neuronales adquiridas con diferentes métodos de contraste. De izquierda a derecha: campo claro, DIC, contraste de fase, fluorescencia
¿Desea documentar o publicar sus resultados?
Si desea tomar una imagen de su muestra o hacer imágenes de células vivas, necesita una cámara de microscopio digital. Especialmente en el caso de imágenes de células vivas con fluorescencia, se recomienda una cámara sensible para minimizar la cantidad de luz de excitación que puede dañar las células. Además de las cámaras CCD y EMDDC bien establecidas, hoy en día se instalaron cámaras sCMOS debido a su alta eficiencia cuántica y velocidad de adquisición. Para obtener más información sobre las cámaras de microscopio digital, lea el artículo Introducción a la tecnología de cámaras digitales.
Además, un gran campo de visión (FOV) ayuda a encontrar áreas interesantes más rápidamente y a obtener imágenes de más celdas al mismo tiempo. Los microscopios de investigación modernos cuentan con un campo de visión de 19 mm en el puerto de la cámara que combina perfectamente con un chip de cámara sCMOS de 19 mm.
A menudo, no es suficiente tomar solo una imagen de su muestra, sino analizar los datos que adquirió. Para este propósito, el software de análisis e imágenes fácil de usar ayuda a obtener datos cuantitativos y a realizar análisis de datos sólidos.
¿Necesita información (3D) de muestras gruesas?
Las muestras gruesas son un desafío para la microscopía. Especialmente en microscopía de campo amplio, donde toda la muestra se ilumina al mismo tiempo, la identificación de las características de una muestra que están enfocadas puede reducirse drásticamente con luz adicional proveniente de regiones desenfocadas.
La compensación computacional puede ayudar a obtener imágenes sin luz desenfocada. Esta técnica se puede aplicar en un solo plano de imagen para obtener resultados instantáneos (ICC: Instant Computational Clearing) o se puede combinar con un paso de desconvolución adicional (SVCC: Small Volume Computational Clearing; LVCC: Large Volume Computational Clearing) para obtener mejores resultados. . La deconvolución reasigna la información de los fotones a su origen y, por lo tanto, proporciona un mejor contraste de las estructuras deseadas en el plano focal. Esto puede permitir a los usuarios distinguir las estructuras de interés del fondo más fácilmente que con las imágenes tradicionales de campo amplio.
Figura 5: RNA-FISH de molécula única en tejido canceroso. RNA-01 (verde), RNA-02 (magenta) Izquierda: datos brutos. Medio: con compensación computacional instantánea. Derecha: después de la compensación computacional de gran volumen. Cortesía del Prof. Andreas Moor, Universidad de Zurich (Suiza).
¿Desea manipular células en el microscopio?
Durante los últimos años se popularizó la fotomanipulación del espécimen. Eso significa que los investigadores no solo observan las células vivas, sino que las manipulan con la ayuda de la luz. La recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo (FRAP) es un ejemplo que ayuda a desenredar los procesos celulares dinámicos. Para este tipo de técnicas de manipulación, a menudo se necesitan fuentes de luz adicionales que deben integrarse en la trayectoria de la luz del microscopio.
Este enfoque no es trivial. El Leica Infinity Port es una solución universal que acopla fuentes de luz adicionales en la trayectoria de la luz del microscopio sin alterar la calidad de la imagen, p. Ej. FRAP, fotoconmutación, ablación u optogenética. Con el adaptador adecuado a mano, los investigadores pueden incluso acoplar sus dispositivos caseros.
Figura 6: El módulo Leica WF FRAP (cuadro negro a la izquierda) se puede conectar con el microscopio de investigación invertido Leica DMi8 a través del puerto Infinity.
¿Cual es su presupuesto?
Una pregunta importante es cuánto dinero puede gastar. Algunos proveedores de microscopios ofrecen configuraciones predefinidas que se adaptan a aplicaciones especiales. Pero, ¿qué sucede si no necesita todos los componentes preconfigurados por los que paga? Es por eso que una configuración gratuita de componentes puede ser más económica que comprar un sistema de microscopio predefinido.
Además, los requisitos de un microscopio pueden cambiar con el tiempo. En este caso, un sistema actualizable tiene ciertas ventajas. Con una configuración predefinida y fija, puede verse atado a una cantidad limitada de aplicaciones. La capacidad de actualización le brinda la libertad de crecer con las demandas cambiantes.
Teniendo en cuenta estos puntos, una plataforma de microscopía modular, como el Leica DMi8, permite al investigador comenzar con un sistema de microscopio asequible que se puede actualizar más adelante y crecer con sus demandas.
Figura 7: Gracias a su modularidad, el Leica DMi8 se puede configurar según las necesidades de los investigadores. Además, se puede actualizar más adelante, si los requisitos han cambiado.
¿Quién usará el microscopio?
La gama de usuarios de microscopios puede ser muy heterogénea. Especialmente en la universidad, los usuarios pueden ser muy experimentados o principiantes absolutos. Por lo tanto, un sistema de microscopio fácil de usar ejecutado por un software intuitivo, como Leica Application Suite X (LAS X), ayuda a que las personas comiencen a trabajar rápidamente y a adquirir datos rápidamente. Por ejemplo, un diseño orientado al flujo de trabajo, asistentes de análisis de imágenes y una integración perfecta de periféricos en el sistema simplifican su trabajo.
Además de los microscopios de investigación de campo amplio, los microscopios estereoscópicos también se utilizan a menudo en los laboratorios de investigación de ciencias de la vida.
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